Um gene humano é isolado através de uma enzima de restrição que separa o DNA em determinados pontos. As enzimas também cortam o genoma bacteriano em um determinado ponto. O DNA recombinante aparece na mistura do gene de interesse humano com o plasmídeo bacteriano.
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Enzimas de restrição fazem a digestão do DNA do organismo doador e do vetor. Então o vetor já linearizado e o fragmento de interesse serão ligados e então passará a ser a célula hospedeira apropriada. É a partir dessa célula que ocorre a expressão da proteína de interesse.
O DNA é formado por duas cadeias de polinucleotídeos (fita), que são constituídas por vários nucleotídeos. Os nucleotídeos são unidos uns aos outros por ligações denominadas fosfodiéster (grupo fosfato ligando dois açúcares de dois nucleotídeos).
Esses pares são formados por ligações entre uma base nitrogenada púrica e outra pirimídica. Mais detalhada e obrigatoriamente, a guanina se liga com a citosina e a adenina se liga com a timina. Assim, o DNA se forma com o pareamento dos nucleotídeos que compõem as duas cadeias antiparalelas.
O fragmento de DNA é inserido em um vetor, que é uma molécula de DNA na qual um gene é inserido para construir a molécula de DNA recombinante. Geralmente os plasmídeos (moléculas de DNA circulares existentes naturalmente nas bactérias) são usados como vetores para clonar fragmentos de DNA.
Como o DNA recombinante é produzido? A obtenção do DNA recombinante baseia-se na técnica de clonagem molecular. O processo pode ser resumido do seguinte modo: O primeiro passo é isolar um fragmento de DNA, que contém o gene de interesse. Lembre-se que cada gene origina uma proteína.
Após uma ligação, o próximo passo é transferir o DNA para as bactérias, em um processo denominado transformação. Então, podemos usar métodos de seleção de antibióticos e análise de DNA para identificar as bactérias que contém o plasmídeo que procuramos.
Assim, o fragmento do gene alvo se une ao vetor, através da DNA ligase, formando o plasmídeo recombinante contendo o gene de interesse. A DNA ligase é a responsável por selar as lacunas do eixo do DNA, funcionando como uma “cola”. A molécula de DNA recombinante produzida é introduzida em um organismo hospedeiro, podendo então ser replicadas.
Clonagem de genes de interesse para expressão e produção de proteínas recombinantes: insulina, hormônio de crescimento genes de humanos clonados em bactérias; Plantas transgênicas; Animais transgênicos. PCR; Bibliotecas genômicas; Vetores; Sequenciamento de DNA; Hibridização; Eletroforese.
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