O método consiste em tratar sucessivamente um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. As bactéricas que adquirem a coloração azul violeta são chamadas de Gram-positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelho são chamadas de Gram-negativas.
O estudo começa com o tratamento da amostra com um corante primário, que é o Cristal Violeta, que, como o nome sugere, colore as bactérias em um tom arroxeado. A amostra, então, passa por uma primeira etapa de lavagem com água destilada e, em seguida, é adicionado um fixador, que normalmente é o Iodo ou Lugol.
O mecanismo da coloração de Gram está baseado na diferença de permeabilidade da parede celular. As bactérias gram negativas apresentam uma elevada concentração de lipídeos e uma delgada parede celular quando comparadas com as bactérias gram positivas.
Técnica de Ziehl-Neelsen
A coloração envolve 3 etapas principais:
A coloração de Gram é um passo muito importante na caracterização e classificação inicial das bactérias. Afinal, esse método de coloração permite que as bactérias sejam visualizadas no microscópio óptico, uma vez que sem a coloração é impossível observá-las ou identificar sua estrutura.
A coloração de Gram tem como objetivo principal diferenciar as bactérias de acordo com as características da parede celular e morfologia geral. ... Bactérias Gram-negativas, que são visualizadas com a coloração rosa/roxo devido ao fato de sere descoradas pelo álcool e coradas pela safranina ou fucsina.
Um corante (cristal violeta) é adicionado, por um a dois minutos, e, em seguida, inserido o lugol, também por um a dois minutos. Dessa reação, forma-se o complexo iodo-pararrosalina na parede celular das bactérias, que coram-se de roxo (nessa fase, tanto as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas retêm o corante).
Entre os fatores que irão diferenciar gram-positivos de gram-negativos, está a coloração das bactérias, a composição e propriedades químicas e físicas das paredes celulares. Outro método de diferenciação é a detecção de quantidade de peptídeoglicano nas bactérias gram-positivas e nas bactérias gram-negativas.
Assim, de acordo com as características observadas no microscópio, as bactérias podem ser classificadas em: Bactérias Gram-positivas, que são visualizadas com a coloração azul devido ao fato de não serem descoradas pelo álcool, uma vez que possuem parede celular mais espessa e os seus poros contraem-se quando expostos ao lugol;
As bactérias gram positivas, por possuírem uma menor concentração de lipídeos, se tornam desidratadas com o tratamento pelo álcool, diminuindo a permeabilidade da parede celular e retendo o primeiro corante. Escorrer o corante. Cobrir com lugol (mordente) por 1 minuto Observar ao microscópio com objetiva de imersão. Fonte: pt.scribd.com
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