Após a corrida do gel, os fragmentos são separados por tamanho. Os fragmentos maiores estão perto da extremidade superior do gel (eletrodo negativo, onde eles começaram), e os fragmentos menores estão próximos da extremidade inferior (eletrodo positivo).
A eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel que possibilita a corrida da amostra. O gel é introduzido dentro de uma solução tampão específica para eletroforese que fornece as condições ideais para a passagem da corrente e a manutenção do valor do pH.
A Eletroforese em Gel de Agarose. A eletroforese, separação de moléculas carregadas em um campo elétrico, é uma técnica essencial em qualquer laboratório e o primeiro passo em vários procedimentos. Por meio dela, as moléculas são separadas umas das outras conforme o tamanho, a forma ou a carga.
A eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de menor massa irão migrar mais rapidamente que as de maior massa.
Como entender os resultados De acordo com o padrão de bandas apresentado, é possível identificar o tipo de hemoglobina do paciente. A hemoglobina A1 (HbA1) apresenta maior peso molecular, não sendo notada tanta migração, enquanto que a HbA2 é mais leve, ficando mais ao fundo do gel.
Para realizar uma eletroforese, um gel de agarose é preparado, o DNA é introduzido em pequenos poços de gel, e então uma corrente elétrica é aplicada através do gel. ... Como o DNA é negativamente carregado, ele é atraído pelo eletrodo positivo.
Como na eletroforese em gel de agarose, as amostras de proteínas são separadas usando um campo elétrico e passam por uma matriz de gel que influencia a migração das proteínas. Em PAGE, em vez da agarose, usamos um produto químico chamado poliacrilamida.
Sempre pipetar na seguinte ordem: água; tampão (baixo = pH 8.8; cima = pH 6.8); acrilamida; SDS....Preparação do gel de poliacrilamida.
| Gel de separação | Gel de empilhamento | |
|---|---|---|
| Água | q.s.p. 25 mL | 8 mL |
| Tampão respectivo | 6,35 mL | 3,1 mL |
| Acrilamida/bisacrilamida | 2,5.(x) = 25 mL | 1,25 mL |
| SDS | 200 μL | 125 μL |
Devido à diferença no tamanho dos poros dessas matrizes, utiliza-se normalmente o gel de agarose para a separação de fragmentos que variam de 0,2 kb a 50 kb ( pares de bases) e o gel de poliacrilamida para separação de fragmentos pequenos, de até 1kb.
Como o DNA é negativamente carregado, ele é atraído pelo eletrodo positivo. Entretanto, para chegar ao eletrodo positivo, o DNA deve migrar através do gel de agarose. Os fragmentos de DNA menores podem migrar através de um gel de agarose mais rapidamente que os fragmentos de DNA maiores.
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